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  • 如何用逆向思維研究癌癥調控機制

    日期:2019-01-16 15:25:33



    長鏈非編碼(long non-coding RNAs?lncRNAs)現如今在癌癥的發生發展中是一個研究熱點,最常見的作用方式是通過海綿結合miRNAs發揮作用。在大多數的研究中,通常是已知研究lncRNAs,通過生物信息學篩選、二代測序等方式,尋找能夠海綿結合的miRNAs;而今天解讀的這篇文獻,是通過已知研究的miRNAs,尋找能夠海綿結合的lncRNAs


    一、篩選和鑒定與肝癌耐藥相關的候選miRNA

    該研究采用TRAIL非耐藥肝癌細胞株HepG2SBel-7402S,以及TRAIL耐藥肝癌細胞株HepG2R?Bel-7402R進行研究。首先使用MTT試驗驗證了耐藥細胞株的HepG2RBel-7402R耐藥性(圖1A)。

    緊接著,由于TRAIL誘導的細胞凋亡是以caspase依賴的方式進行的,因此,在上述四株細胞株中,檢測了CASP8CASP3mRNA和蛋白的表達情況,結果表明兩者的表達量在耐藥細胞株中均下調(圖1B-C)。




    為了研究其中的耐藥機制,該研究使用在線工具(TargetscanRNA22,miRWalkStarbase)搜索可能調控caspase 3caspase8的候選miRNA。結合GEO數據庫,選擇耐藥腫瘤細胞中的非下調miRNA (1D)。在篩選出的這些miRNA中,通過構建mimic過表達模型發現,對caspase8下調力度最強的是miR-24-3p,對caspase 3下調力度最強的是miR-221(圖1E-F)。


    二、MiR-24/miR-221促進肝癌細胞對TRAIL的抗性

    選取上述研究中選取的miR-24miR-221,通過構建過表達和敲降的細胞模型,采取Q-PCR、流式細胞術等實驗,證明miR-24miR-221促進肝癌細胞對TRAIL的抗性(圖2)。



    三、MiR-24/miR-221通過直接靶向負性調控caspase8/3

    為了進一步確證miR-24/miR-221caspase 8/3的調控作用,本部分研究采用了熒光素酶報告基因試驗、和Western blot實驗,證明了miR-24/miR-221通過直接靶向負性調控caspase 8/3(圖3)。


    四、抑制CASC2能促進TRAIL抗性

    前期的研究報道證明,在肝癌中CASC2能抑制肝癌的增殖。因此,該研究在耐藥細胞株HepG2R?Bel-7402R中敲降CASC2,使用MTT實驗和流式細胞術,證明敲降CASC2能夠抑制細胞的TRAIL抗性(圖4)。


    五、CASC2通過直接靶向對miR-24miR-221進行負調控

    ?通過miRCode預測顯示,CASC2?miR-24/miR-221有直接作用的位點,因此,該研究設計了熒光素酶報告基因試驗和RIP實驗驗證,并且敲降CASC2miR-24miR-221的表達量顯著提高,證明了CASC2通過直接靶向對miR-24miR-221進行負調控(圖5)。


    六、CASC2通過miR-24/miR-221調節TRAIL抗性

    該部分實驗通過在耐藥細胞株HepG2R?Bel-7402R中敲降CASC2/miR-24/miR-221進行營救實驗,使用MTT試驗和流式細胞術,證明了CASC2通過miR-24/miR-221調節TRAIL抗性,并且通過Western blot實驗驗證了CASC2/ miR-24/miR-221caspase 8/3的調控作用(圖6)。


    總結:該研究是一項比較經典的lncRNA/miRNA/蛋白對于癌癥的調控作用的研究,不過該研究的出發點是蛋白(caspase 8/3),隨后找到調控蛋白的miRNAmiR-24/miR-221),最后找到調控miRNAlncRNACASC2),完成了這一調控路徑。這種逆向的研究思路,或許值得大家借鑒一下。



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